Ученые раскрыли неожиданное новое применение кофе

Фото из открытых источников

Исследователи выявили распространенный бытовой напиток как эффективную, нетоксичную замену опасным химическим веществам, традиционно используемым в микроскопии высокого разрешения. Новое исследование демонстрирует, что обычный эспрессо может окрашивать биологические образцы для электронной микроскопии с четкостью и детализацией, сравнимыми со стандартными радиоактивными растворами. Результаты исследования были опубликованы в журнале Methods.

Чтобы понять масштаб этого открытия, необходимо сначала разобраться в невидимых проблемах электронной микроскопии. Биологи используют просвечивающие электронные микроскопы (ПЭМ) для изучения внутренних структур клеток в нанометровом масштабе. В то время как световые микроскопы используют фотоны для освещения объекта, ПЭМ используют пучки ускоренных электронов.

Разница в источниках освещения позволяет получать гораздо большее увеличение. Однако это создает фундаментальную проблему для биологических наблюдений. Живые организмы в основном состоят из легких химических элементов, таких как углерод, водород, кислород и азот.

Эти легкие элементы практически не взаимодействуют с электронными пучками. Когда электронный пучок проходит через срез биологической ткани, электроны проходят насквозь, не отклоняясь и не рассеиваясь. В результате получается изображение практически без контраста, что делает сложный клеточный механизм невидимым для наблюдателя.

На протяжении десятилетий решением проблемы было насыщение тканей тяжелыми металлами. Этот процесс известен как позитивное окрашивание. Ионы тяжелых металлов связываются с клеточными структурами, такими как мембраны или белки.

Когда электронный пучок попадает на эти покрытые металлом участки, электроны отскакивают. Это создает темные области на итоговом изображении, в то время как неокрашенные участки остаются светлыми. Полученный контраст позволяет исследователям составить карту географии клетки.

В настоящее время «золотым стандартом» для этого процесса является химическое вещество под названием ацетат уранила. Это соль, полученная из урана. Она исключительно эффективно связывается с биологическими липидами и белками, обеспечивая четкую структуру клеточных мембран и ДНК.

Однако ацетат уранила имеет серьезные недостатки. Он крайне токсичен для почек и химически радиоактивен. Использование такого опасного вещества требует строгих протоколов безопасности, дорогостоящей утилизации отходов и сложной нормативной документации.

В некоторых лабораториях его хранение даже полностью запрещено. Вследствие этого научное сообщество ищет «зеленую» альтернативу, которая была бы безопасной, дешевой и эффективной. Эти поиски привели группу исследователей из Австрии в комнату отдыха на кухне.

Клаудия Майрхофер, специалист по ультрамикротомии из Грацского центра электронной микроскопии, возглавила это исследование. Ее работа сосредоточена на физической подготовке образцов, которая включает в себя нарезку тканей на срезы тоньше длины волны видимого света. Она сотрудничала с коллегами из Грацского технологического университета и Инсбрукского университета.

Вдохновение для исследования пришло из обыденного наблюдения. Майрхофер заметила, что кофе, оставленный в чашке слишком долго, образует стойкие пятна, которые трудно удалить. Она предположила, что соединения, ответственные за эти въевшиеся пятна, могут также эффективно связываться с биологическими тканями.

«Идея использовать эспрессо в качестве красящего вещества пришла мне в голову, когда я увидел засохшие пятна на использованных кофейных чашках», — сказала Майрхофер. «Первоначальные испытания показали, что кофе окрашивает биологические образцы и усиливает контрастность».

Для тщательной проверки этой гипотезы команда разработала сравнительное исследование. Им нужно было выяснить, как кофе соотносится с радиоактивным стандартом — ацетатом уранила. Они также сравнили его с другими потенциальными заменителями, описанными в литературе.

В качестве биологического объекта исследования ученые выбрали рыбок данио-рерио. В частности, они сосредоточились на митохондриях в клетках этих рыбок. Митохондрии идеально подходят для такого рода исследований, поскольку обладают сложными двухслойными мембранами.

Если окрашивание эффективно, эти мембраны выглядят как четкие, отчетливые линии. Если окрашивание неэффективно, мембраны выглядят размытыми или сливаются с фоном. Команда приготовила крепкий раствор эспрессо, используя зерна кофе Робуста.

Они также протестировали раствор чистой хлорогеновой кислоты. Эта кислота является основным химическим компонентом кофе. Исследователи предположили, что именно она может быть активным ингредиентом, ответственным за эффект окрашивания.

Группа исследователей обработала ультратонкие срезы тканей рыбок данио различными веществами. Затем они исследовали образцы с помощью просвечивающего электронного микроскопа в идентичных технических условиях. Это гарантировало, что любые различия в качестве изображения были обусловлены красителем, а не настройками прибора.

Исторически сложилось так, что оценка качества микроскопического изображения была субъективным процессом. Опытный микроскопист смотрел на экран и оценивал, достаточно ли контраста. Авторы этого исследования стремились к более строгому критерию оценки.

Они разработали объективный метод количественной оценки «интерференционного контраста». Он включал математический анализ цифровых изображений. Они измеряли интенсивность пикселей окрашенных мембран и сравнивали ее с интенсивностью пикселей окружающего клеточного материала.

В результате этого расчета было получено числовое значение, отражающее качество окрашивания. Более высокое значение указывало на лучшее разделение интересующего объекта и фона. Это позволило объективно оценить различные красящие вещества.

Визуальные результаты были мгновенными и впечатляющими. Образцы, обработанные раствором эспрессо, дали высококачественные изображения. Митохондриальные мембраны были четко видны и хорошо различимы.

При анализе с помощью специализированного программного обеспечения кофейное пятно показало себя превосходно. Майрхофер отметила успех этого бытового напитка. «Эспрессо обеспечил сравнительно очень хорошие значения контрастности, в некоторых случаях они были даже лучше, чем у ацетата уранила», — пояснила она.

Исследование показало, что кофейное пятно создает контраст, позволяющий легко дифференцировать клеточные структуры. Это не просто приемлемая замена, а конкурентоспособная альтернатива. Чистая хлорогеновая кислота также показала хорошие результаты, подтверждая свою важную роль в процессе связывания.

Исследователи также попытались использовать экстракт чая улун. Ранее в научной литературе он предлагался в качестве потенциального красителя. Однако в этом конкретном случае экстракт чая не позволил получить четкие изображения без артефактов.

Последствия этих выводов носят как экономический, так и практический характер. Ацетат уранила дорог в покупке и утилизации. Кофе же можно купить практически в каждом продуктовом магазине за гораздо меньшую цену.

Кроме того, кофе не представляет никакой опасности для здоровья ученых, работающих с ним. Для его использования не требуется специальная вентиляция, защита от излучения или государственные лицензии. Он значительно упрощает рабочий процесс в лаборатории.

В исследовании отмечалось, что, хотя контраст был хорошим, соотношение «сигнал-шум» для кофе несколько отличалось от такового для урана. Уран — очень тяжелый элемент, поэтому он очень эффективно рассеивает электроны. Органические молекулы, такие как молекулы кофе, легче.

Несмотря на меньшую плотность, кофейное пятно оказалось достаточным для создания необходимого изображения. Это опровергает предположение о том, что только тяжелые металлы могут служить эффективными красителями для электронной микроскопии. Это открывает возможности для применения методов органической химии.

Конечно, у этого исследования есть свои оговорки. Исследование было сосредоточено конкретно на митохондриях рыбок данио. Биологические ткани сильно различаются по своему химическому составу.

Краситель, хорошо работающий с липидами митохондриальной мембраны, может плохо связываться с белком в мышечном волокне или нитью ДНК. Авторы признают, что это лишь первый шаг, а не универсальное решение. Для широкого применения потребуются дальнейшие исследования.

Необходима валидация на более широком спектре биологических образцов. Исследователям необходимо убедиться, что кофе не вносит нежелательных артефактов или искажений в различные типы тканей. Последовательность является ключевым фактором в научной визуализации.

Руководитель группы Ильзе Летофски-Папст подчеркнула необходимость дальнейшей проверки. «Наши результаты показывают, что кофе является серьезной альтернативой ацетату уранила», — заявила она. «Однако для широкого применения в электронной микроскопии в биологических науках все еще необходимы дальнейшие исследования на различных типах тканей».

Несмотря на необходимость проведения дополнительных экспериментов, это исследование демонстрирует сдвиг в подходах ученых к подготовке образцов. Оно предполагает, что ответ на сложные лабораторные проблемы не всегда может заключаться в синтезированных химических веществах. Иногда решение находится в соседнем котле.