Японские ученые повысили эффективность разрезания и сборки ДНК в 5 раз

Фото из открытых источников

Редактирование генов работает путем вырезания и вставки совпадающих фрагментов ДНК. Однако современные инструменты с трудом справляются с задачей точного вырезания необходимых для их соединения фрагментов.

Группа исследователей из Японии обнаружила, что наночастицы серебра разрезают ДНК именно там, где это необходимо, оставляя после себя концы, гораздо лучше подходящие для соединения, чем те, которые образуются ферментами.

Полученная конструкция работает в два-пять раз эффективнее стандартного метода, а секрет ее практической применимости заключался в покрытии тем же полимером, который используется в слабительных и кремах для кожи.

Генная инженерия основана на простой операции, выполняемой с высокой точностью: разрезание цепи ДНК в выбранной точке, а затем присоединение к месту разреза другой последовательности.

Эта деятельность лежит в основе селекции сельскохозяйственных культур, лечения генетических заболеваний и использования животных моделей для разработки лекарств.

Соединение фрагментов происходит за счет липких концов — коротких выступающих участков одноцепочечной ДНК, остающихся после разреза. Два фрагмента с совпадающими выступами находят друг друга и образуют пару.

Для получения нужного липкого слоя необходимо сделать надрез точно в нужном месте, и именно здесь существующие инструменты оказываются неэффективными.

Традиционный подход использует рестрикционные ферменты для разрезания ДНК и ДНК-лигазу Т4 для соединения фрагментов.

Рестрикционные ферменты распознают только определенные последовательности ДНК, поэтому место разреза нельзя выбрать произвольно. Оно должно находиться в таком месте, где фермент готов работать.

Кроме того, они, как правило, оставляют короткие выступы, часто по четыре основания, что ограничивает сцепление двух фрагментов и снижает эффективность соединения.

Группа исследователей под руководством профессора Хироши Абе и доцента Масахито Инагаки из Нагойского университета, работая совместно с профессором Нацухисой Ока из Университета Гифу, занялась поиском химической альтернативы ферментам.

Они вернулись к реакции, впервые описанной в период с 1990 по 1992 год, в которой ионы серебра разрезают ДНК, химически модифицированную тиольной группой в определенном положении.

Резка удалась. Проблема была во всем остальном, поскольку ионы серебра также прикреплялись там, где они были нежелательны, и вызывали осаждение смеси.

Впоследствии удалось восстановить лишь около 14% ДНК, чего совершенно недостаточно для получения полезных результатов.

Команда заменила ионы серебра на наночастицы серебра, рассудив, что эти частицы можно отделить от смеси центрифугой, и ДНК будет легче извлечь.

Эффективность расщепления достигала примерно 50% при 70°C и почти 100% при 95°C в течение двух часов.

Эти температуры решили одну проблему и создали другую, поскольку длинные молекулы ДНК не выдерживают такой температуры в неизмененном виде.

Решение заключалось в покрытии наночастиц полиэтиленгликолем, водорастворимым полимером, для обеспечения их стабильности и равномерного распределения.

Благодаря покрытию эффективность расщепления при температуре 37°C возросла с 36% до 92%, хотя для достижения этого результата потребовалось 31 час.

Дальнейшая оптимизация позволила сократить этот процесс до приемлемого временного масштаба. «В итоге мы оптимизировали условия до практического уровня и при комнатной температуре достигли эффективности расщепления с помощью ПЭГ-модифицированного реагента выше 91% при 50°C всего за один-два часа», — говорит Инагаки.

Оказалось, что наночастицы выполняют вторую функцию, для которой никто их не разрабатывал.

Нежелательные фрагменты ДНК оставались прилипшими к поверхности наночастиц, в то время как фрагменты с липкими концами оставались свободными в растворе.

Встроенная система разделения позволила повысить конечный коэффициент извлечения с 14% до 98%, превратив худший показатель метода в один из лучших.

Поскольку место разреза выбирается химическим путем, а не в соответствии с предпочтениями фермента, выступающие части могут быть длиннее.

Команда получила фрагменты с липкими концами длиной в 8 оснований, которые рестрикционным ферментам сложно создать, и их соединение с помощью ДНК-лигазы Т4 прошло примерно в два раза эффективнее, чем при использовании традиционного метода.

Дальнейшее увеличение выступающей части конструкции еще больше улучшило ситуацию. Выступ в 18 оснований обеспечил эффективность соединения в 44%, по сравнению с 8% для обычного выступа в 4 основания.

Это пятикратное значение, и оно определяется длиной выступа, а не самим серебром.

Метод, работающий с очищенной ДНК в пробирке, все равно должен производить вещество, которое клетка сможет прочитать.

Команда собрала фрагмент, кодирующий зеленый флуоресцентный белок, и ввела его в клетки HeLa человека, после чего клетки засветились.

Клетки, экспрессирующие GFP, подтверждают, что ДНК была собрана правильно, поскольку неправильно собранная последовательность не привела бы к образованию функционального белка.

Ограничение является специфическим, и исследователи четко его указывают. Все продемонстрированные до сих пор методы основаны на соединении двух фрагментов ДНК. Создание чего-либо в масштабе генома подразумевает одновременное соединение множества фрагментов, и вопрос о том, выдержит ли метод этот скачок, остается непроверенным.

«Мы показали, что два фрагмента ДНК можно соединить. Теперь нам нужно подтвердить, можно ли соединить несколько фрагментов одновременно — это ключевой шаг для создания ДНК геномного масштаба», — говорит Инагаки.

Этот подход также требует предварительной химической модификации ДНК, что является дополнительным этапом подготовки, который ферментам не нужен.

Результаты работы были опубликованы в журнале Nucleic Acids Research, а предполагаемые области применения точно соответствуют тем сферам, где узкое место представляет собой разработка длинной синтетической ДНК.

Инагаки указал на создание библиотек мРНК для вакцин против рака, генной терапии, искусственных белковых препаратов и генетически модифицированных культур.

Все они зависят от надежной сборки длинных последовательностей, что является именно тем этапом, который продвигается медленно, и ни один из них не достигается на основе демонстрации всего лишь двух фрагментов.