Учёным впервые удалось восстановить активность в мозге криогенизированной мыши

Фото из открытых источников

Немецкие ученые показали, что гиппокамп, ключевой орган памяти, может быть криоконсервирован и вновь начать функционировать. Группа исследователей из Университета имени Фридриха-Александра в Эрлангене-Нюрнберге (Германия) достигла важной вехи в области криоконсервации: впервые им удалось восстановить функциональную активность в тканях головного мозга взрослых мышей после витрификации при температуре -196 °C.

Исследование, опубликованное в журнале Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS), показывает, что гиппокамп — область мозга, отвечающая за память и обучение, — может подвергаться процессу витрификации, храниться в течение нескольких дней, а после размораживания восстанавливать свою структуру, метаболизм и, что наиболее важно, способность передавать электрические сигналы между нейронами.

Введение к статье описывает кратковременное восстановление гиппокампа взрослых мышей после витрификации срезов мозга и всего мозга in situ. Сохраняются ключевые характеристики гиппокампа, включая структурную целостность, метаболическую реактивность, нейронную возбудимость, а также синаптическую передачу и пластичность.

Чтобы понять суть этого достижения, необходимо сначала понять проблему, которую оно пытается решить. Когда биологическая ткань замораживается обычными методами, содержащаяся в ней вода превращается в лед. Образующиеся кристаллы льда разрушают клеточные структуры, повреждают мембраны и разрывают связи между нейронами. Это все равно, как если бы при заморозке компьютера лед разорвал все провода и соединения в его схемах.

Витрификация — это другая техника. Вместо замораживания цель состоит в том, чтобы затвердеть ткань до стеклообразного состояния, подобного стеклу, без образования кристаллов льда. Для этого большая часть воды в ткани замещается криозащитными веществами — смесью химических соединений, действующих как антифриз, — а затем охлаждается настолько быстро, что молекулы воды не успевают расположиться и образовать кристаллы.

Группа исследователей под руководством Александра Германа использовала вариант стекловидного раствора под названием V3, который содержит диметилсульфоксид, этиленгликоль, формамид и поливинилпирролидон.

Исследователи протестировали витрифицированную ткань, используя несколько методов. Первым делом они убедились, что структура осталась неповрежденной. С помощью электронной микроскопии они обнаружили, что нейроны сохранили свои дендриты (отростки, принимающие сигналы), дендритные шипики (места, где происходят соединения) и митохондрии (энергетические центры клетки).

Затем они измерили метаболизм. Используя анализатор Seahorse, измеряющий потребление кислорода клетками, они обнаружили, что митохондрии в витрифицированной ткани все еще функционируют, хотя и на несколько более низком уровне, чем в свежей ткани. Важно отметить, что метаболическое повреждение было в основном вызвано воздействием криопротекторов, а не самим процессом замораживания.

Но решающим критерием было выяснить, способны ли нейроны передавать сигналы. Для этого ученые провели электрофизиологические исследования, электрически стимулируя связи между нейронами (синапсы) и измеряя ответную реакцию.

Результаты показали, что синапсы реагировали. Базовая передача работала. Также функционировала кратковременная пластичность, то есть способность синапсов усиливаться или ослабевать в ответ на недавнюю активность. И что еще более важно: долговременная потенциация (ДВП), процесс, который считается клеточной основой обучения и памяти.

Интересно, что не все нейроны реагировали на этот процесс одинаково. Пирамидальные клетки в области CA1 демонстрировали снижение возбудимости после витрификации: для запуска потенциала действия им требовалось больше тока. Напротив, гранулярные клетки в зубчатой извилине (другой области гиппокампа) сохраняли свою способность к генерации потенциалов действия и даже демонстрировали некоторые изменения в своих электрических свойствах, которые исследователи интерпретируют как возможные адаптации.

Различная чувствительность к процессу витрификации может быть обусловлена вариациями размера клеток, свойств мембран или внутренней метаболической активности, объясняют авторы. Эти различия могут влиять на то, как клетки реагируют на проникновение и выведение криопротекторов, а также на их токсичность.

Исследователи также подтвердили, что тормозная сеть мозга — «тормоза», предотвращающие неконтролируемую активность, — осталась неповрежденной. Они зарегистрировали активность интернейронов, клеток, ответственных за подавление активности, и подтвердили, что они функционируют нормально. Это крайне важно, поскольку дисбаланс между возбуждением и торможением может спровоцировать эпилепсию или другие расстройства.

Следующий шаг был более амбициозным: витрификация не только отдельных частей, но и всего мозга внутри черепа. Для этого исследователи разработали протокол сосудистой перфузии, вводя криозащитные растворы через аорту, чтобы они достигали всего мозга.

Этот процесс оказался гораздо сложнее. Гематоэнцефалический барьер, защищающий мозг от чужеродных веществ, затрудняет проникновение криопротекторов. Особенно проблематичны клетки, называемые астроцитами, которые покрывают кровеносные сосуды и экспрессируют белок аквапорин 4, облегчающий прохождение воды, но не криопротекторов. Это приводит к тому, что мозг теряет воду и обезвоживается во время перфузии до того, как криопротекторы проникнут в клетки.

Исследователи протестировали различные стратегии. Решением стал протокол «перемежающегося уравновешивания», при котором перфузия чередовалась с раствором для витрификации и с раствором-носителем для частичной регидратации мозга. С помощью этого метода они получили мозги, сохранившие от 70% до 80% своей массы и выпуклую форму. После витрификации, хранения и размораживания этих мозгов они повторили анализ.

Результаты были более вариабельными — жизнеспособную ткань удалось получить только в одной из трех попыток, — но в тех случаях, когда эксперимент увенчался успехом, нейроны в зубчатой извилине проявляли активность. Мембранный потенциал этих клеток был несколько более деполяризованным (менее отрицательным), чем у контрольных образцов, но они генерировали потенциалы действия нормально и даже демонстрировали большую возбудимость при интенсивной стимуляции.

Сами авторы предупреждают об ограничениях своего исследования. Главное из них заключается в том, что они наблюдали за тканью лишь несколько часов после размораживания — образцы мозга естественным образом разрушаются через 10 или 15 часов, — поэтому они не знают, что происходит в долгосрочной перспективе.

Они также не анализировали молекулярные эффекты: какие гены активируются или деактивируются в ответ на стресс, вызванный процессом, или происходят ли изменения в белках. Кроме того, используемый метод охлаждения, проводимость через медный цилиндр, работает только для небольших образцов. Для целых человеческих органов необходимы методы объемного охлаждения, такие как радиочастотный нагрев или магнитные наночастицы.

Авторы уточняют, что наши результаты не следует интерпретировать как непосредственно применимые к криоконсервации крупных органов. Они также добавляют предупреждение относительно возможных последствий для крионики (сохранения человеческих тел в надежде на их оживление в будущем): «Наша модель не отражает прижизненные изменения [изменения, происходящие в момент смерти], поэтому потенциальные последствия для этических и моральных дискуссий, касающихся криоконсервации умерших, ограничены».

Несмотря на эти ограничения, исследование открывает новые возможности. В научных исследованиях оно может позволить распределять образцы мозга между лабораториями без потери их функциональности, улучшить воспроизводимость экспериментов и сократить количество необходимых животных. Оно также может облегчить структурные исследования мозга в состоянии, близком к естественному, с использованием таких методов, как криозамещение для электронной микроскопии.

Но это открытие имеет более глубокий смысл. Оно показывает, что активность мозга — это не процесс, требующий непрерывного потока движущихся молекул. Даже после полной остановки, когда молекулы неподвижны в стеклообразном состоянии при -196 °C, активность возобновляется, как только возвращаются нормальные условия.

Это подтверждает идею о том, что функция мозга является эмергентным свойством его структуры, заключают авторы в обсуждении. Другими словами, если структура — связи между нейронами — сохраняется в неизменном виде, функция может восстановиться.

Как заявила исследовательская группа: «Мы продемонстрировали, что мозг удивительно устойчив не только к почти полной остановке развития вследствие гипотермии, но даже к полной остановке в стеклообразном состоянии при -196 °C. Это исследование представляет собой шаг вперед в понимании пределов толерантности мозговой ткани и немного приближает к все еще далекой возможности сохранения сложных органов для трансплантации или, в еще более умозрительном будущем, для других применений».

В заключение авторы размышляют о значении своих результатов: «Наши результаты расширяют известные биофизические пределы гипотермической остановки головного мозга, демонстрируя восстановление после полного прекращения молекулярной подвижности в стеклообразном состоянии, и тем самым способствуют достижению цели структурного и функционального сохранения нервной ткани».