Учёные смогли вывести светящуюся каракатицу

Фото из открытых источников

Когда Тесса Монтегю узнала о CRISPR, системе редактирования генов, которая, как предполагалось, должна была упростить модификацию любого организма, она обратила свой взор на каракатицу. Нейробиолог из Колумбийского университета мечтала ввести в эмбрионы каракатицы гены, которые заставляли бы нейроны флуоресцировать при активации. Вспышки позволили бы ей отслеживать, как мозг этого щупальцеобразного существа контролирует одно из его самых поразительных поведенческих проявлений: маскировку путем копирования воспринимаемых в окружающей среде узоров на кожу. В отличие от большинства животных, говорит она, «кальмары действительно могут рассказать нам, что они видят».

Но это было совсем не просто. Введение инструментов для редактирования генов в оплодотворенную яйцеклетку требовало удаления десятков слоев желеобразной оболочки; разработки щипцов, которые сжимали бы яйцеклетку с точно заданной силой; создания иглы с правильным углом для прокалывания ее почти невидимого, линзообразного эмбриона; и поддержания жизни хрупких детенышей каракатицы после их вылупления. «Иногда мне кажется, что мы пережили все возможные виды неудач», — говорит Монтегю.

Спустя шесть лет и тысячи эмбрионов она достигла важной вехи: семь каракатиц светятся красным под флуоресцентным светом. Каждая клетка их бескостных тел содержит ген, кодирующий синтетический флуоресцентный белок — даже их яйцеклетки и сперматозоиды, а это значит, что их детеныши каракатиц тоже светятся. Работа, опубликованная сегодня в виде препринта на bioRxiv, знаменует собой первый случай успешного добавления нового гена к головоногим моллюскам — группе животных, в которую входят осьминоги и кальмары.

Мечта Монтегю о создании нейронов, флуоресцирующих в активном состоянии, еще далека от реализации, но первый успех ее группы воодушевил исследователей головоногих моллюсков. «Это фантастический шаг вперед в наших возможностях создания трансгенных организмов», — говорит Джошуа Розенталь, биолог, изучающий головоногих моллюсков в Морской биологической лаборатории. «Это откроет множество новых возможностей».

Головоногие моллюски когда-то были неотъемлемой частью биологии: в 1950-х годах исследователи впервые обнаружили, как нейроны передают сигналы, изучая гигантские аксоны кальмаров. Но в молекулярной биологии «они отстали от расы модельных организмов», поскольку мыши, мухи и рыбки данио заняли более высокое место, говорит Кэрри Альбертин, биолог из Гарвардского университета и соавтор статьи Монтегю. Доминирование этих других видов самоподкреплялось: по мере публикации новых данных об их размножении, репродуктивной функции и геномах, исследователи, желавшие использовать их, получали большее преимущество.

Исследователям головоногих, напротив, пришлось с нуля изучать, как обеспечить выживание и размножение каждого вида в аквариуме, как работает процесс откладки яиц и как вводить в яйца технологии редактирования генов. Размножение «действительно сильно различается от вида к виду», — говорит Розенталь. У всех разные формы и оболочки, которые исследователям необходимо прокалывать, не повреждая яйцо или эмбрион.

Несколько исследовательских групп использовали CRISPR и другие инструменты для удаления генов у головоногих моллюсков. Например, в исследовании 2023 года были отключены гены пигментации, что позволило получить кальмаров-альбиносов. Монтегю хотел пойти дальше и добавить ген.

Чтобы внедрить инструменты генного редактирования в своих каракатиц, Монтегю годами работала под микроскопом в темноте с крошечными манипуляторами, что привело к травмам запястья и повреждению глаз. Технология CRISPR оказалась очень неэффективной для каракатиц: Монтегю пришлось ввести ген флуоресценции более чем 4000 эмбрионам, прежде чем она увидела светящиеся сперматозоиды у одного самца каракатицы. Он был очень маленьким и боялся самок в своем аквариуме, но в конце концов ему удалось установить связь. В одно воскресное утро Монтегю нашла кладку икры. «Я затаила дыхание и включила флуоресцентный микроскоп — он светился, и я расплакалась», — вспоминает она. «Это был один из лучших моментов в моей жизни».

Позднее усовершенствования упростили этот процесс. Вместо CRISPR Монтегю использовала более эффективную технологию, называемую транспозонами: небольшие «кассеты» ДНК, которые встраиваются в случайные места генома. Это тоже было непросто. Чтобы гарантировать, что клетки будут производить флуоресцентный белок, ей пришлось секвенировать геном каракатицы (это был первый подобный опыт), обнаружить геномные области, предположительно участвующие в экспрессии генов, и скопировать эти последовательности в кассету.

«Ее успех — это невероятно, невероятно захватывающе», — говорит Ева Сеунтженс, нейробиолог-исследователь развития из Лёвенского университета, работающая над созданием первого осьминога с отредактированными генами. «Это очень вдохновляет людей, которые хотят заниматься подобной работой».

На конференции в прошлом месяце Сеунтженс рассказала, как ее лаборатория использовала CRISPR для нарушения работы гена осьминога, участвующего в раннем развитии мозга, в результате чего у эмбриона, по-видимому, отсутствовала часть мозга, отвечающая за память и обучение. Эти крошечные осьминоги никогда не вылупятся, поскольку европейские правила запрещают создание головоногих моллюсков, которые могут пострадать. Но Сеунтженс говорит, что эмбрионы выглядят здоровыми. Она планирует использовать их для изучения типов клеток в мозге осьминогов и эволюции интеллекта.

Ее команда столкнулась со своими трудностями. У исследователей был только один шанс собрать яйца для каждого животного, поскольку осьминоги нерестятся только один раз за свою жизнь. Используя ультразвук, они измерили размер яичников, чтобы предсказать, когда осьминог начнет откладывать свои 500 000 яиц, а затем проанализировали цвет яиц, чтобы отобрать для манипуляций только самые свежие эмбрионы, которые еще не начали делиться.

«Все эти глупые, практические вещи очень сложно решить», — говорит Сеунтженс, и это мнение разделяют и другие исследователи головоногих моллюсков. Например, фермент может не функционировать должным образом при высоких концентрациях соли, необходимых клеткам головоногих, или микроскоп, который можно прикрепить к черепу мыши для визуализации ее нейронов, не имеет ничего, к чему можно было бы прикрепиться у осьминога без костей.

По словам Альбертина, возможность узнать что-то новое об эволюции и биологии оправдывает затраченные усилия. «Большая часть нашей информации сосредоточена всего на нескольких видах животных, но природа предложила множество решений проблем».

Как говорит Кристофер Ниелл, биолог из Университета Орегона, разрабатывающий вирусы для переноса генов в клетки кальмаров, исследования должны стать проще по мере того, как ученые будут создавать и обмениваться модельными головоногими моллюсками. Например, лаборатория Альбертина пытается разработать короткохвостого кальмара в качестве основной модельной головоногий моллюск и создать первую трансгенную версию. (О размножении этого вида известно так мало, что команда обратилась к записям эмбриологов XIX века.)

Теперь Монтегю переходит к своей настоящей цели: созданию нейронов у каракатиц, которые мигают при активации. Она ожидает новых трудностей. По ее словам, разработка нового вида головоногих моллюсков «требует глубокой страсти и преданности делу, на которые способен только тот, кто посвятил этому всю свою карьеру».